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Par : F Colomb
Publié : 20 janvier 2010
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TP Cinétique enzymatique


- Détermination de la vitesse initiale d’une réaction enzymatique

- Détermination des constantes cinétiques Km et Vmax d’une réaction enzymatique

- Etude de l’influence de la concentration enzymatique et d’un effecteur sur une réaction enzymatique

- Etude de l’influence du pH et de la température sur une réaction enzymatique

Par deux méthodes :

Par méthode cinétique

L’enzyme étudiée est la phosphatase alcaline qui catalyse l’hydrolyse des liaisons esters lorsque l’acide engagé est l’acide phosphorique mono estérifié.

On utilise la cinétique d’hydrolyse du PNPP (ParaNitroPhényl Phosphate) à 20°C à pH=9,8.

Le PNP (ParaNitroPhénol) est jaune en milieu alcalin. On peut donc suivre l’apparition du PNP au cours de l’hydrolyse en enregistrant l’absorbance du mélange réactionnel à 410 nm en fonction du temps.

Par méthode point par point

L’enzyme étudiée est la b fructosidase qui est une hydrolase capable de scinder les liaisons béta fructofuranosiques.

La réaction utilisée est l’hydrolyse du saccharose (glucide non réducteur) en fructose et glucose (glucides réducteurs) en milieu tamponné pH=4,7.

Le mélange d’oses réducteurs appelé sucre inverti est ensuite dosé par méthode colorimétrique au dinitrosalicylate.

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