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Publié : 12 juin 2012
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Du Roquefort au laboratoire !

L’objectif de cet article est de :
- proposer une activité technologique de fermentation s’articulant autour de la production d’un arôme par bioconversion microbiologique,
- proposer une illustration concrète de technologies bioindustrielles,
- proposer une association microbiologie / biochimie en BTS BioAC, reposant sur le suivi de la production de l’arôme par chromatographie gazeuse.


Les photographies et les extraits de résultats expérimentaux proposés dans cet article reposent sur une séance réalisée avec les étudiants de BTS Bioanalyses et contrôles 2ème année du Lycée Senghor d’Evreux.

Production de l’arôme de Roquefort par bioconversion microbiologique

Objectif de la séance

Penicillium roquefortii est une moisissure utilisée pour la confection du Roquefort et d’autres fromages à pâte dite persillée (bleu d’Auvergne, bleu de Bresse, etc…). Elle produit à partir d’acides gras des méthyl cétones, composés arômatiques, qui sont les principaux arômes des fromages bleus.

L’objectif de la séance est de réaliser la bioconversion, en fermenteur de laboratoire, d’un acide gras à 8C, l’acide octanoïque, en utilisant comme catalyseur des spores de Penicillium roquefortii. La principale méthyl cétone produite étant la 2-heptanone.

En pratique, les souches de P.roquefortii transforment les acides gras sous forme de différentes méthyl cétones : on retrouve principalement l’heptanone, mais également à l’état de traces, de l’octanone, de la nonanone et de la dodécanone notamment.

- L’utilisation d’un micro-organisme et d’un substrat naturel, l’acide octanoïque, permet de considérer l’arôme produit comme étant naturel (directive européenne du 22 juin 1988). Les arômes produits peuvent donc être utilisés dans la formulation de produits alimentaires (crème de fromage au goût de Roquefort, soupes, biscuits apéritifs, etc…).

Conditions opératoires de réalisation de la bioconversion

  • Production des méthyl-cétones chez les spores de P.roquefortii

- Les voies métaboliques permettant la bioconversion d’un acide gras chez P.roquefortii sont complexes. Les voies métaboliques ci-dessous montrent les différentes étapes de la transformation de l’acide octanoïque en 2-heptanone, le principal arôme produit :

- La voie prioritaire à droite représente la β-oxydation : voie catabolique prioritairement utilisée par les cellules pour dégrader les acides gras. En effet elle entraine indirectement la libération d’une quantité d’énergie importante sous forme d’ATP. La voie de formation des méthyl-cétones (à gauche) ne présente par contre aucun caractère énergétique : elle n’est donc pas favorisée par les cellules et ne peut être induite que dans un second temps, dans certaines conditions (concentration en acide octanoïque suffisante pour "saturer" la β-oxydation et oxygénation soutenue).

  • Production préalable du biocatalyseur : préparation de spores de P.roquefortii

La préparation des spores nécessite 3 grandes étapes :

1-La moisissure est prélevée par écouvillonnage dans les cavités d’un fromage persillé commercial (Roquefort Société) et mis en culture sur milieu gélosé Sabouraud – chloramphénicol. L’incubation est réalisée à 30°C ou température ambiante, dans une chambre humide pendant 3 à 5 jours.


2-Production de spores

Pour obtenir une grande quantité de spores, recueillir par écouvillonnage les spores de deux boites de culture et les mettre en suspension dans 10 mL d’une solution stérile de Tween 80 à 0,05%.
Ensemencer le milieu de sporulation (riz + milieu de Czapek) préalablement préparé, en répartissant les 10 mL en plusieurs gouttes sur toute la surface du milieu. Incuber 7 à 10 jours à 30°C en position inclinée, en chambre humide.

3-Récolte des spores

La récolte des spores est réalisée à l’aide de 150-200 mL d’une solution de Tween 80 à 0,05% en eau physiologique dont l’action détersive permettra de décoller les spores dont la paroi est très hydrophobe.
Après agitation pour extraire les spores, puis filtration sur gaze stérile, les spores sont concentrées dans un flacon stérile.

  • Milieu de bioconversion et conditions de fermentation

La bioconversion est réalisée en fermenteur de laboratoire.

Exemple de fermenteur de laboratoire :

Conditions opératoires :

- Milieu de bioconversion comportant une base nutritive de type microbiologie industrielle (lactosérum + corn steep liquor) et une source de carbone additionnelle, l’acide octanoïque, le substrat de la bioconversion. Le milieu est préalablement préparé par les étudiants puis introduit dans le fermenteur et autoclavé.

- Durée de fermentation de l’ordre de 20 à 25 heures sans renouvellement du milieu réactionnel (batch).

- Conditions permettant d’induire la formation de méthyl-cétones :
concentration initiale en acide octanoïque de 15 mmol/L, agitation fixée à 250 rpm et un taux d’oxygène dissous d’au moins 60% permettant une bonne oxygénation du milieu réactionnel.

- pH = 6,5 (stabilisé avec un tampon phosphate) et une température de 25°C permettant une bonne activité de spores de P.roquefortii.

- Concentration en spores totale de 5x10^10 / L de milieu de bioconversion pour avoir une production d’arômes satisfaisante.

  • Suivi de la bioconversion

Le suivi microbiologique ne nécessite que quelques contrôles :

- Contrôle de la filamentation éventuelle sur Etat – frais coloré au bleu de méthylène pour vérifier l’absence de croissance mycélienne.

- Contrôle de pureté bactérienne du milieu de fermentation par isolement sur gélose nutritive + actidione.

- Contrôle de viabilité des spores par isolement sur gélose Sabouraud + chloramphénicol.

- Contrôle des paramètres de fermentation sur le fermenteur pour vérifier le bon déroulement de la bioconversion.

A ce stade, le plus intéressant est de suivre l’apparition de l’arôme par chromatographie gazeuse.

Suivi de la bioconversion par chromatographie gazeuse

Conditions chromatographiques

La technique utilisée est une chromatographie de partage en phase gazeuse.

Exemple de chromatographe gaz à acquisition informatique :

La colonne capillaire de type DB1 présente les caractéristiques suivantes :
- phase stationnaire apolaire de diméthylpolysiloxane
- longueur 15 m, diamètre intérieur 0,53 mm, épaisseur 1,5 µm
- utilisable entre -60°C et 325/350°C
- la phase mobile et gaz vecteur : azote.
Le détecteur utilisé est un détecteur à ionisation de flamme (FID).

Les réglages suivants ont été utilisés :
- débit gaz vecteur : environ 15 mL/min
- volume d’injection : 0,5 µL
- injecteur en mode splitless
- température four : gradient de 50°C à 250°C avec une montée en température de 50°C/min
- température injecteur = 150°C
- température détecteur = 250°C

Voir l’animation ci-dessous expliquant le fonctionnement d’une chromatographe en phase gazeuse :

Source : www.anetexis.com

Préparation des échantillons de milieu de bioconversion avant injection

Le milieu de culture est prélevé à différents temps dans le fermenteur, puis filtré sur Millipore 0,45 µm. Les prélèvements sont maintenus au froid.

Dans un tube à hémolyse en verre avec bouchon à vis, introduire :
- 2 mL du milieu de bioconversion filtré,
- 0,2 mL d’une solution d’acide chlorhydrique à 0,5 mol/L,
- 0,5 mL de solution d’octanone dans l’hexane (étalon interne).
Vortexer environ 20 secondes et laisser décanter.

La chromatographie sera réalisée sur 0,5 µL de la phase hexane (supérieure) : l’arôme, l’étalon interne et l’acide octanoïque ayant été extrait par l’hexane.

Exemple de chromatogramme obtenu :

Temps de rétention (min) : 2,83 = heptanone - 3,45 = étalon interne - 4,25 = acide octanoïque.

On peut aussi remarquer vers 3,95 des traces, probablement liées à l’apparition d’autres méthyl cétones minoritaires (nonanone par exemple...).

Exploitation possible

- Compréhension du protocole : rechercher la composition qualitative du milieu de bioconversion utilisé et justifier le rôle de chaque constituant. Justifier le recours à l’actidione et au chloramphénicol dans les milieux d’isolement utilisés.

- A partir des analyses CG réalisées sur les différents prélèvements, identifier de façon qualitative les différents arômes éventuellement produits en cours de culture.

- En comparant les aires des pics obtenus pour l’étalon interne, l’acide octanoïque et la 2-heptanone, calculer les concentrations en acide octanoïque et en 2-heptanone à chaque temps. Tracer les courbes d’évolution des concentrations en fonction du temps.

Exemple de résultats (bioconversion réalisée sur 25 heures)

- Calculer la productivité productivité totale de la 2-heptanone.

- Calculer le coefficient de conversion de la 2-heptanone par rapport au substrat (Y 2-heptanone /acide octanoïque).