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Par : F Colomb
Publié : 27 mars 2011
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Production de GFP par E Coli

Le but de la manipulation est de transformer une souche d’E Coli K12 avec un plasmide (pGLO) contenant deux gènes d’intérêts, l’un pour la sélection et l’autre pour la mise en évidence de la transformation par synthèse de GFP :
- un gène de résistance à l’ampicilline ;
- un gène codant pour la GFP.

La GFP synthétisé sera ensuite extraite par chromatographie (TP2) puis caractérisé par électrophorèse (TP3)

Eléments de Principe

http://biotech.spip.ac-rouen.fr/spip.php?article99

Protocole de TP

PDF - 44.6 ko
Transformation d’Ecoli K12 par le plasmide pGLO

Exemples de questionnement

Autour du principe :

- Définir un plasmide
- Définir la transformation
- Justifier la composition du milieu de transformation
- A quoi sert le choc thermique
- Quels sont les caractères acquis par les bactéries transformées ?
- Citer les deux autres types de transferts de matériels génétiques

Autour de la manipulation

Questionnement préalable

- Quels résultats attendez vous ?

Plasmide+pGLO+pGLO-pGLO-pGLO
Milieu de cultureLB/ampLB/amp/araLB/ampLB
Résultats attendus

- Sur quel(s) milieu(x) allez vous trouver des colonies de E Coli semblables à celles initialement utilisées pour la transformation ?
- Sur quelle(s) boite(s) de Pétri allez vous trouver des cellules bactériennes transformées ?
- Quels milieux pourront être comparés pour déterminer si une transformation bactérienne a bien eu lieu ?
- Quelles différences observez vous entre les résultats des boites +pGLO/LB/amp et +pGLO/LB/amp/ara ?
- Quelles sont les boites de Pétri qui servent de contrôle dans ce test ? Que contrôlent-elles ?

Analyses des résultats obtenus

- Dresser un tableau de résultats en indiquant le nombre, la couleur, la fluorescence des colonies.
- Décrire l’observation de la solution plasmidique pGLO
- Quel est le nombre total de cellules fluorescentes déposées sur le milieu +pGLO/LB/amp/ara ?
- Sachant que sur ce milieu l’équivallent de 0,16µg d’ADN plasmidique ont été déposé, calculer l’efficacité de la transformation (Nbre de transformation/µg d’ADN)